Especies Patógenas De Los DIPLOCOCOS.
Streptococcus pneumoniae.
Streptococcus pneumoniae se ubica dentro de las
principales prioridades como problema de salud pú-
blica tanto los países industrializados como aquellos
menos desarrollados. Es responsable de elevada
morbilidad y letalidad ya que es uno de
los principales agentes causales de una
gran variedad de cuadros
clínicos, infecciones benignas como otitis
media y sinusitis agudas, e infecciones severas
como septicemia, meningitis y neumonía. La neumonía, como
síndrome es responsable de la muerte de
aproximadamente 4 millones de niños bajo 5 años de edad y
de un número similar de adultos sobre 60 años en el
mundo, la mayoría de estas muertes son atribuibles a
S. pneumoniae como agente único o asociado
a virus respiratorios. Según datos aportados por el BID,
en Latinoamérica se producen cada año 9.000 casos
de meningitis bacteriana aguda (MBA), con
un 10%e letalidad promedio y 30% de secuelas.
Actualmente, S. pneumoniae es la segunda
causa de MBA
en Chile, responsable del 15,2% de
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| Tincion de Gram de S. pneuminiae. |
los casos, después de Neisseria meningitidis
que se asocia al
48,6%. Haemophilus influenzae tipo b ha disminuido en forma importante su incidencia (inferior al 5%en 1999) como consecuencia de la
incorporación de
la vacuna conjugada anti Hib en el
PAI en julio de
1996. (Díaz JM et al, comunicación personal).
Con el paso del tiempo el impacto de
las infecciones por S. pneumoniae se ha acentuado.
En las
últimas dos décadas se ha producido un cambio en
la epidemiología de las infecciones por este agente,
con un aumento real de la incidencia, especialmente
de infecciones sistémicas como meningitis, en paí-
ses menos privilegiados. Otro cambio importante ha
sido la emergencia, con fuerza creciente, de cepas
resistentes a penicilina, antibiótico que constituía el
tratamiento de elección. La resistencia a penicilina
se asocia en forma heterogénea con resistencia a
otros antimicrobianos como cefalosporinas de
tercera generación, cloranfenicol y cotrimoxazol
por citarlos más importantes. Otro aspecto nuevo que destacar
es la aparición de brotes de infecciones invasoras
por S. pneumoniae en algunas comunidades
cerradas como guarderías y jardines infantiles.
Es interesante conocer la biología y características
de S. pneumoniae para entender la interacción entre
agente y el huésped humano y poder de este modo
enfrentar el manejo y la prevención de estas
infecciones de manera efectiva.
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| S. pneumoniae cultvado en Agar Sangre |
Diagnóstico
Examen directo (tinción de Gram), cultivo, aislamiento si es necesario,
identificación y pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos. Identificación
presuntiva (prueba de la sensibilidad a la optoquina o pruebas bioquímicas).
Identificación: Reacción de Quellung: con el antisuero polivalente (reacciona con
todos los serotipos) y serotipificación con el antisuero específico para cada
serotipo. En ocasiones en que los cultivos sean negativos se puede realizar la
demostración del antígeno capsular en líquidos orgánicos como: LCR, líquido
pleural, etc. Existe una prueba rápida de detección de antígeno en orina.
Neisseria gonorrhoeae.
Neisseria gonorrhoeae (gonococo) es un diplococo Gram negativo, oxidasa positivo, que causa la gonococia, una enfermedad de transmisión sexual que se presenta en los humanos. Se diferencia de otros tipos de Neisseria por la prueba de la fermentación de carbohidratos, fermentando solamente a la glucosa. Se caracteriza por ser de difícil cultivo, siendo muy exigente a nivel nutricional y a la vez muy sensible a sustancias que se encuentran en los medio de cultivo corrientes. Suele utilizarse para este fin medios no selectivos enriquecidos con factores de crecimiento o selectivos, logrado con una mezcla de antibióticos, como el medio de Thayer-Martin (con vancomicina, nistatina, colimicina y trimetoprim-sulfametoxazol). Requiere una atmósfera con 5-10% de CO2.
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| N. gonorrhoeae tincion de Gram ( - ) |
Diagnóstico de laboratorio
Es importante que la muestra se transporte rápidamente al laboratorio.
Directo
-Tinción de Gram.
-Nuevos métodos de diagnóstico rápido (inmunofluorescencia directa con anticuerpos
monoclonales, ELISA, sondas de ADN y PCR).
Cultivo y aislamiento:
En medios selectivos (Thayer-Martin modificado o el medio NYC). (5-10% e CO2).
Identificación:Pruebas bioquímicas o técnicas serológicas (IF directa, ELISA, coaglutinación).
CULTIVOS.
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| N. gonorrhoeae cultivados en Agar sangre (izquierdo) y nutritivo (derecho) |
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| Agar Chocolate. Pruebs bioquimicas.
El aislamiento de N.gonorrhoeae a partir de muestras clínicas se realiza a partir de muestras no estériles procedentes del tracto genital y la orofaringe, que contiene gran cantidad de flora acompañante. Por ello, se recurre a medios selectivos como, por ejemplo, el medio Thayer-Martin cuya composición es Agar Chocolate suplementado con antibióticos:
Además de este medio, también se puede utilizar el medio NYC (New York City) de características similares al anterior.
Además de un medio selectivo, es conveniente utilizar un medio general como el Agar Chocolate, ya que el medio anterior, por el alto contenido en antibióticos, puede impedir el crecimiento de hasta un 10% de las Neisserias presentes en la muestra.
Para favorecer el crecimiento, las placas deben incubarse en atmósfera húmeda y con una concentración de CO2 de entre un 5-10%. Tras 24-48 horas de incubación se observan en el medio de cultivo colonias pequeñas y grisáceas. Paralelamente al cultivo se realiza una tinción de Gram, donde estos m.o se observan como diplococos Gram-, incluidos en el interior de leucocitos polimorfonucleares.
El examen directo de la muestra es muy útil cuando se realiza a partir de exudados uretrales y, en menor grado, cuando se trata de exudados endocervicales.
Moraxella catarrhalis.  Moraxella catarrhalis es una bacteria gram negativa, aeróbica, oxidasa positiva con forma de diplococos que puede colonizar y causar infección del tracto respiratorio en humanos. |
Clínicamente estas bacterias son conocidas por causar otitis media, bronquitis, sinusitis, y laringitis. En pacientes ancianos fumadores pesados crónicos con EPOC (Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica)la M. catarrhalis está asociada con bronconeumonía, también como exacerbaciones del EPOC subyacente.
La frecuencia más alta de colonización por M. catarrhalis parece ocurrir aproximadamente a los 2 años de edad, con una sorprendente diferencia en las tasas de colonización entre niños y adultos (muy alta a muy baja).
La prioridad de las investigaciones actuales incluyen ensayos para encontrar una vacuna eficaz para este organismo genotípicamente diverso, también para determinar los factores envueltos en la virulencia e.g. resistencia al complemento. El lipooligosacarido es considerado un posible factor de virulencia.
CULTIVOS'
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| Moraxella catarrhalis Agar Sangre |
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| Moraxella catarrhalis en Agar sangre y Agar Chocolate |
Pruebas bioquimicas.
Aisladas estas colonias se realizo la prueba de catalasa y oxidasa.
-CATALASA.
Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra el la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. La principal excepción es Streptococcus.
Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes géneros:
- Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+).
- Bacillus (+) de Clostridium (-).
- Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las excepciones de C.pyogenes y C.haemolyticum, ambos -) deErysipelothrix (-)
Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede hacerse siguiendo dos técnicas:
- Método del portaobjetos (recomendado):
- Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio.
- Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre el microorganismo sin mezclarlo con el cultivo.
- Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).
- Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante.
- Si se invierte el orden del método (extender la colonia sobre el agua oxigenada) pueden producirse falsos positivos.
- Método del tubo de ensayo:
- Agregar 1ml de H2O2 al 3% directamente a un cultivo puro de agar en slant densamente inoculado.
- Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).
Precauciones: Si se utilizan para esta prueba cultivos procedentes de agar sangre, se debe tener la precaución de no retirar algo de agar con el asa al retirar la colonia ya que los eritrocitos del medio contienen catalasa y su presencia dará un falso resultado positivo.
-OXIDASA.
Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromooxidasa que activa la oxidación del citocromo que es reducido por el oxígeno molecular que produce agua o peróxido de hidrógeno según la especie bacteriana. El oxígeno actúa por tanto como aceptor final de electrones en la cadena transportadora de electrones. Por lo general, el sistema citocromooxidasa sólo se encuentra en los organismos aerobios, algunos anaerobios facultativos y, excepcionalmente, en algún microaerófilo (Vibrio fetus), pero los anaerobios estrictos carecen de actividad oxidasa. Asímismo, la presencia de oxidasa va ligada a la producción de catalasa, ya que ésta degrada el peróxido de hidrógeno que se produce como consecuencia de la reducción del oxígeno y cuya acumulación es tóxica.
La prueba de la oxidasa se usa sobre todo para
- Identificar todas las especies de Neisseria (+)
- Diferenciar Pseudomonas de los miembros oxidasa negativos de las enterobacterias.
El reactivo de la oxidasa más recomendado es la solución acuosa al 1% de diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (reactivo de Kovacs). Es menos tóxico y mucho más sensible que el correspondiente compuesto dimetilo (reactivo de Gordon y McLeod), pero es más caro. Este reactivo tiñe las colonias oxidasa positivas de color lavanda que vira gradualmente a púrpura-negruzco intenso.
Realización de la prueba:
- Método en placa directa
- Agregar directamente 2-3 gotas de reactivo a algunas colonias. No inundar toda la placa y no invertirla.
- Observar los cambios de color. Con el reactivo de Kovacs la reacción se produce en unos 10-15 segundos, mientras que con el de Gordon y McLeod es dentro de los 10-30 minutos.
- Método indirecto sobre papel
- Colocar un trozo de papel de filtro de 3x3cm aproximadamente en una placa de Petri.
- Agregar 2-3 gotas del reactivo de Kovacs en el centro del papel.
- Extender con el asa de siembra una colonia sobre el papel impregnado.
- La reacción de color positiva se produce a los 5-10 segundos.
Especie Patógenas De Los ESTREPTOCOCOS.
Streptococcus Pyogenes, el cual se encuentra clasificado en el grupo A de los Streptococcus. Este es el patógeno más frecuente, es una importante causa de las enfermedades supurativas y no supurativas. Aunque son la causa mas frecuente de faringitis bacteriana, estos microorganismos son importantes por que pueden producir enfermedades graves con riesgo vital. De hecho, las noticias de estas bacterias que “devoran la carne” han inundado tanto la literatura científica como la prensa sensacionalista.
El estreptococo beta hemolítico del grupo A es un coco
Gram positivo que se agrupa en cadenas, posee cápsula y
su pared está constituida por carbohidratos, proteínas y
ácido lipoteicoico. Es microaerofílico, catalasa negativa y
sensible a la bacitracina.
Streptococcus agalactiae, o estreptococo ß-hemolítico del grupo B (EGB), es un coco grampositivo, catalasa y oxidasa negativo,
anaerobio facultativo, que se presenta formando cadenas de longitud variable. El EGB puede crecer en medios simples, aunque
los medios suplementados con sangre o suero favorecen su crecimiento. Tras 18-24 h de incubación en agar sangre, las colonias
son de unos 2 mm de diámetro, lisas y rodeadas por un halo de ß-hemólisis, aunque existen algunas cepas no hemolíticas. El
empleo de medios selectivos favorece la recuperación del EGB. Como agentes selectivos se emplean, gentamicina, ácido nalidíxico, colistina o cristal violeta.
Pruebas biquimicas.
La identificación de S. agalactiae se realizó a través de
morfología y hemólisis β de las colonias, observación de
cadenas en la coloración de Gram del cultivo en medio
líquido, prueba de catalasa negativa, crecimiento en
NaCl 6,5% variable, prueba de bilis esculina negativa,
prueba de CAMP positiva y aglutinación con anticuerpos específicos contra polisacáridos de S. agalactiae.
Estreptococos viridans.
Es uno de los patógenos bacterianos más importante de los seres humanos. Este microorganismo es la causa bacteriana más frecuente de faringitis aguda y también origina distintas infecciones cutáneas y sistémicas. Las infecciones por Streptococcus pyogenes son las enfermedades infecciosas más frecuentes. En general, suelen presentarse en niños, con una frecuencia máxima entre los 4 y los 7 años. El periodo de incubación es de uno a tres días. Los gérmenes entran a través de lesiones cutáneas o mucosas y causan infecciones locales que pueden evolucionar a una sepsis. Posteriormente puede pasar a abscesos periamigdalares, sinusitis u otras complicaciones. La escarlatina es una forma especial de faringitis estreptocócica que, además de la amigdalitis, provoca un exantema miliar (y un enantema). Un segundo grupo de enfermedades son las infecciones cutáneas (pioderma, impétigo, erisipela). Una enfermedad muy grave es la fascitis necrotizante, con o sin miositis. El aspecto especial de esta infección reside en el inicio súbito de los síntomas, la rápida progresión en personas por lo demás sanas, y el síndrome de shock tóxico.
Pruebas bioquimicas.
En la tinción de Gram directa de muestras clínicas se observan cadenas cortas, en cambio desde los medios de cultivo líquidos se observan cadenas mas largas. El crecimiento óptimo es en agar sangre, pero se inhibe cuando el medio contiene una alta concentración de glucosa. A las 24 horas de incubación a 37°C se forman colonias blancas de 1 - 2 mm. con una marcada zona de beta hemólisis.
Especies Patógenas De Los Estreptococos.
Staphylococcus.
Los estafilococos crecen fácilmente sobre casi todos los medios bacteriológicos, en cultivos su crecimiento es mejor en el medio sal manitol y agar sangre, esto puede llegar a dar problemas en el corazón ó hígado tales como la perdida de un hígado es un coco anaerobio facultativo, esto significa que puede crecer tanto en condiciones con aire como carente de este. Su mayor velocidad de crecimiento es a 5 - 25 °C; pero también se puede ver en activa fisión binaria entre 30 y27 °C. Además, producen catalasa, lo que los diferencia de los estreptococos. Tiene importancia médica principalmente el S. aureus, y, el S. epidermidis.
S. aureus.
Conocido comúnmente como estafilococo áureo o dorado, es una bacteria anaerobia facultativa grampositiva productora de coagulasa y catalasa que se encuentra ampliamente distribuida por todo el mundo, estimándose que una de cada tres personas se hallan colonizadas, que no infectadas, por ella.
Puede producir una amplia gama de enfermedades, que van desde infecciones cutáneas y de las mucosas relativamente benignas, tales como foliculitis, forunculosis o conjuntivitis, hasta enfermedades de riesgo vital, como celulitis, abscesos profundos, osteomielitis, meningitis, sepsis, endocarditis o neumonía.
Pruebas bioquimicas.
Prueba de la Coagulasa
La coagulasa es un enzima capaz de desnaturalizar la bibrina del plasma. El objetivo es buscar en factor de aglutinación de los microorganismos cuando estos se mezclan con el plasma. Esta prueba se utiliza para diferenciar microorganismos del genero Staphylococcus.
Procedimiento:
Preparamos una mezcla de 0,1 ml. de CCC (caldo cerebro corazon) y 0,3 ml. de plasma de conejo en un tubo de ensayo previamente esterilizado. La muestra ya contiene cepas de St. Aureus. Tapamos el tubo de ensayo con algodón hidrofílico y lo llevamos a baño María a 37° C durante una hora, observando la muestra cada 15 minutos. Al completa la hora, sacamos las muestras y observamos sus resultados.
S. epidermidis.
Es una especie bacteriana del género Staphylococcus, consistente en cocos Gram-positivos arreglados en grupos se presenta frecuentemente en la piel de humanos y de animales y en membranas mucosas. Es sencible al antibiótico novobiocina.
Es la causa menos común en infecciones oportunistas.
Es un mediador de infecciones
nosocomiales. Su crecimiento no produce hemolisis.
No fermenta manitol.
No es pigmentado.
Coagulasa negativo.
Es saprofita
Pruebas bioquimicas.
Prueba del Manitol
Sirve para detectar si los gérmenes son capaces de fermentar el manitol liberando productos ácidos que serán detectados gracias al indicador rojo de fenol que cambiará a color amarillo. Para esta prueba el medio manitol movilidad incluye 7,5 g/l de D-Manita. Bacterias manitol (-) son, dentro de las enterobacterias,Proteus mirabilis, Proteus vulgaris y Shigella dysenteriae. Entre las bacterias de importancia clínica, la prueba del manitol sirve para diferenciarStaphylococcus aureus (+) de Staphylococcus epidermidis (-).
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